單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性測定試劑盒(微量法)資料

　　產(chǎn)品信息

　　產(chǎn)品名稱測定方法產(chǎn)品編號規(guī)格

　　單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性測定試劑盒微量法0管/96樣

　　正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定

　　測定意義

　　MDHAR催化MDHA還原生成AsA，在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。

　　測定原理

　　MDHAR 催化 NADH 還原MDHA 生成 AsA和NAD+，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD+沒有。通過測定340 nm光吸收下降速率，來計算出MDHAR活性。

　　實驗中所需儀器及設(shè)備

　　研缽、冰、臺式離心機(jī)、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和雙蒸水

　　試劑組成和配置

　　試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

　　試劑二：液體20mL×1瓶，室溫保存。

　　試劑三：粉劑×1瓶(棕色)，4℃保存。臨用前加入3 mL蒸餾水充分溶解。

　　試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解。

　　試劑五：液體15μL×1瓶，4℃保存。臨用前加3 mL試劑二充分溶解。

　　粗酶液提取

　　組織：按照組織質(zhì)量(g)：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例(建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

　　. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量(104個)：試劑一體積(mL)為500~1000：1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一)，冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min);8000g ，4℃離心20min，取上清液置冰上混勻待測。

　　血清等液體：直接測定。

　　MDHAR測定操作

　　1.分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

　　2.試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。

　　3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL試劑三、20μL試劑四、20μL試劑五和120μL試劑二，最后加入20μL上清液，迅速混勻后于340nm比色，記錄30s和150s的吸光值30s和150s的吸光值A(chǔ)1和A2，△A=A1-A2。

　　MDHAR活性計算公式

　　a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

　　(1). 按蛋白濃度計算

　　MDHAR活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

　　MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109]÷(Cpr×V樣)÷T= 804×△A ÷Cpr

　　(2). 按樣本質(zhì)量計算

　　MDHAR活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH 為1U。

　　MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T= 804×△A ÷W

　　(3)按細(xì)胞數(shù)量計算

　　MDHAR活性單位定義：25℃中每104個細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

　　MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T= 804×△A ÷ 細(xì)胞數(shù)量

　　(4)按液體體積計算

　　MDHAR活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

　　MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反總×109÷V樣)÷T= 804×△A

　　ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm;d：比色皿光徑，1cm;V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10-4L;V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL;V樣總：提取液體積，1 mL;Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒;W ：樣品質(zhì)量;T：反應(yīng)時間，2min。

　　b.使用96孔板測定的計算公式如下：

　　(1). 按蛋白濃度計算

　　MDHAR活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

　　MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109]÷(Cpr×V樣)÷T= 1608×△A ÷Cpr

　　(2). 按樣本質(zhì)量計算

　　MDHAR活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH 為1U。

　　MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T= 1608×△A ÷W

　　(3)按細(xì)胞數(shù)量計算

　　MDHAR活性單位定義：25℃中每104個細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

　　MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T= 1608×△A ÷ 細(xì)胞數(shù)量

　　(4)按液體體積計算

　　MDHAR活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

　　MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反總×109÷V樣)÷T=1608×△A

　　ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm;d：96孔板光徑，0.5cm;V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10-4L;V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL;V樣總：提取液體積，1 mL;Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒;W ：樣品質(zhì)量;T：反應(yīng)時間，2min。

　　注意事項

　　臨用前配制的試劑未使用完的4℃保存，3天內(nèi)使用完。

　　本產(chǎn)品僅作科研用途!

　　注：以上資料僅供參考，不作為實驗數(shù)據(jù)，具體請咨詢品牌供應(yīng)商或技術(shù)老師;

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