Elisa實驗：吸光度值過高是什么原因

　　Elisa實驗：吸光度值過高是什么原因

　　ELISA實驗中出現吸光度值過高(比如陽性對照爆表，或者陰性背景很深)，通常意味著顯色反應過強，超出了酶標儀的檢測范圍或預期的反應閾值。

　　這會導致標準曲線在高濃度區域變得平坦，從而影響定量的準確性。以下是導致吸光度值過高的主要原因及相應的解決辦法：

　　1. 樣本濃度過高(超出檢測范圍)

　　這是常見的原因之一。

　　現象：即使是低稀釋倍數的樣本，OD值也普遍大于2.5甚至3.0，標準曲線的高濃度點呈飽和狀態。

　　解決辦法：

　　預實驗：對于未知濃度的樣本，建議先做預實驗確定大致濃度范圍。

　　增加稀釋倍數：根據預實驗結果，使用試劑盒提供的樣本稀釋液對樣本進行更大倍數的稀釋(例如從1:2稀釋改為1:10或1:100)，確保OD值落在標準曲線的中間范圍。

　　注意：計算最終濃度時，記得乘以相應的稀釋倍數。

　　2. 洗板不充分(背景高)

　　如果洗板步驟未能有效去除未結合的酶標抗體或鏈霉親和素，這些殘留物會催化底物顯色，導致整個孔(包括陰性對照和空白孔)的背景信號升高。

　　現象：空白孔(Blank)或陰性對照孔的OD值明顯偏高(例如大于0.1)，整個板子看起來顏色都很深。

　　解決辦法：

　　增加洗滌次數：嚴格按照說明書要求的次數洗滌，建議至少洗板5次。如果背景高，可酌情增加至7次。

　　確保洗滌液注滿：每孔必須注滿洗滌液(通常300-350µL)，不能只加一點點。

　　充分浸泡：每次洗滌后，讓洗滌液在孔內停留30-60秒，以充分解離非特異性結合。

　　拍干：洗滌后，務必將板子在厚的吸水紙上用力拍干，確保孔內無殘留液體。如果有自動洗板機，請檢查吸液針和注液針是否堵塞。

　　3. 孵育條件不當(反應過度)

　　孵育溫度過高或時間過長，會加速酶促反應，導致顯色過深。

　　現象：顯色很快，剛加入底物沒多久就變成深藍色，或者還沒加終止液顏色就已經很深。

　　解決辦法：

　　控制溫度：確保孵育溫度恒定在37℃(或說明書要求的溫度)。避免將培養箱溫度設得過高。

　　精準計時：每一步孵育都使用計時器嚴格計時，不要憑感覺。特別是底物(TMB)的孵育時間，通常需要避光精確控制。

　　避免堆疊：不要將兩塊板疊在一起孵育，這會導致下面的板受熱不均、溫度過高。

　　4. 試劑問題

　　濃縮洗滌液結晶：如果洗滌液在低溫下儲存產生了鹽結晶，而未充分溶解就使用，可能導致洗滌液濃度不準，無法有效去除雜質。

　　解決辦法：使用前若發現洗滌液有結晶，需將其置于37℃水浴中振搖溶解，溶解后再稀釋使用。

　　酶結合物濃度過高或失活后復活：雖然失活通常導致信號低，但如果濃縮液配置錯誤，也可能導致濃度偏高。

　　5. 顯色時間過長

　　TMB底物顯色是動力學反應，時間越長顏色越深。

　　現象：剛加入TMB不久，所有孔都開始快速變藍。

　　解決辦法：

　　避光孵育：TMB底物需要避光保存和孵育，光線會加速其非特異性反應。

　　觀察顏色：在加入TMB后，可以觀察標準品的高濃度孔。當其呈現深藍色(通常梯度明顯時)，即可立即加入終止液，不一定非要等到說明書規定的最長時間。

　　立即終止：到達規定時間后，應立即加入終止液(通常是2M H?SO?)，加入后顏色會由藍變黃。終止后需在15-30分鐘內完成讀數，時間過長顏色會逐漸淬滅或變渾濁。

　　6. 樣本干擾(溶血或脂血)

　　樣本本身的特性有時會干擾檢測。

　　溶血：紅細胞破裂釋放的血紅蛋白具有類似過氧化物酶的活性，可以直接催化TMB顯色，導致假陽性或讀數偏高。

　　解決辦法：盡量不使用溶血樣本。采血時輕柔操作，避免劇烈震蕩，分離血清時吸凈紅細胞。

　　微生物污染：樣本或試劑被細菌污染，細菌的代謝產物(如內源性過氧化物酶)也會導致背景升高。

　　7. 酶標儀設置問題

　　波長錯誤：使用了錯誤的檢測波長(例如用了630nm校正波長，卻只讀取了450nm的主波長，而沒有減去背景)。

　　解決辦法：核對儀器設置，確保檢測波長正確(如450nm)，如果設置了參比波長(如630nm)，確保兩者配合無誤。

　　注：以上僅供參考，本試劑僅供科研使用，不作為實際數據，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術老師。

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